mikroskop

2.1     Pengertian Mikroskop dan Mikroskopi

Mikroskop merupakan instrument yang paling banyak digunakan dan juga paling bermanfaat di laboratorium mikroskopi. Mikroskop adalah alat yang menggunakan lensa untuk mendapatkan gambar yang diperbesar dan dengan demikian dapat memperoleh rincian yang sekecil-kecilnya dari obyek yang terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Keahlian dalam menggunakan mikroskop disebut dengan mikroskopi. Mikroskop memungkinkan pembesaran dalam kisaran luas dari seratus kali sampai ribuan kali.

2.2     Jenis-jenis Mikroskop yang digunakan Untuk Mengamati Mikroorganisme

Mikroskop secara garis beras dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok besar yaitu mikroskop cahaya dan mikroskop elektron. Mikroskop cahaya menggunakan gelombang cahaya untuk memperoleh bayangan yang diperbesar. Mikroskop cahaya merupakan mikroskop yang kesemuanya menggunakan sistem lensa optis mencakup mikroskop medan terang, medan gelap, fluoresensi dan fase kontras. Mikroskop elektron menggunakan berkas elektron sebagai pengganti gelombang cahaya untuk memperoleh bayangan yang diperbesar.

A.       Mikroskop Cahaya (Compound light microscpe)

Mikroskop cahaya  adalah sebuah mikroskop yang menggunakan cahaya untuk membentuk bayangannya, cahaya yang digunakan adalah cahaya matahari atau cahaya lampu. Pada mikroskop konvensional, sumber cahaya masih berasal dari sinar matahari yang dipantulkan dengan suatu cermin datar ataupun cekung yang terdapat dibawah kondensor. Cermin ini akan mengarahkan cahaya dari luar ke dalam kondensor.

Ada beberapa jenis mikroskop cahaya diantaranya adalah sebagai berikut:

·           Mikroskop Medan Terang

Mikroskop medan terang digunakan untuk memperbesar gambaran objek yang diuji, untuk menentukan ukuran, susunan karakteristik, dan motilitas bakteri dan mikroba lain di lingkungan alami. Pada mikroskop ini, medan mikroskop atau daerah yang diamati diterangi sehingga objek yang sedang diamati tampak lebih gelap dari latar belakangnya. Perbesaran terbatas pada daya pisah suatu mikroskop yaitu kemampuannya untuk menghasilkan bayangan berlainan dari dua objek yang berdekatan. Daya pisah suatu mikroskop cahaya ditentukan oleh panjang gelombang cahaya dan sifat lensa objektif dan lensa kondensor yang dikenal dengan apertur numerik (numerical aperture). Lensa objektif memperbesar gambaran objek biasanya 4-100 kali dan lensa okuler umumnya memperbesar gambaran semu tidak lebih dari 10-15 kali. Yang memberikan perbesaran permulaan adalah sistem lensa objektif kemudian diperbesar lagi oleh sistem lensa okuler. Perbesaran total ditentukan dengan mengalikan perbesaran lensa objektif dengan daya perbesaran lensa  mata (okuler).

·      Mikroskop Medan Gelap

Mikroskop medan gelap digunakan untuk melihat spirochaeta seperti Treponema (penyebab sifilis) Leptospira (leptospirosis). Mikroskop ini mempunyai kondensor yang mencegah cahaya ditransmisikan melalui bahan, tapi sebaliknya menyebabkan cahaya merefleksikan bahan pada sudut tertentu, sehingga objek kelihatan lebih besar bersinar dengan latar belakang yang gelap. Dengan menahan sebagian berkas cahaya yang masuk ke dalam kondensor, cincin medan gelap hanya melewatkan berkas cahaya yang mengenai objek pada slide spesimen agar memasuki objektif. Karena itu objeknya (mikroba) menjadi diterangi dalam medan mikroskopik yang seharusnya gelap.

·      Mikroskop Fluoresensi

Mikroskop Fluoresensi sering dipakai di laboratorium rumah sakit dan klinis. Mikroskop ini digunakan untuk memeriksa spesimen yang telah diwarnai dengan zat-zat pewarna  Fluorokrom sehingga memungkinkan identifikasi mikroorganisme dengan cepat. Bahan seperti itu dinamakan Fluoresen dan fenomena ini dinamakan Mikroskop Fluorescensi (pendar fluor). Mikroskop ini banyak digunakan dalam mikrobiolgi dan imunologi, dan telah dikembangkan untuk mendeteksi antigen mikroba pada bahan pemeriksaan dengan jalan mewarnainya dengan antibodi spesifik yang telah diberi tanda/label dengan zat warna fluoresen (immunofluorescence).

·      Mikroskop Fase Kontras

            Mikroskop fase kontras digunakan untuk menambah kontras antara sel dengan latar belakangnya, antara struktur dalam sel dengan sitoplasma. Mikroskop fase kontras digunakan untuk melihat objek dengan indeks refraksi sinar yang berbeda. Fase perubahan bagian dalam sistem lensa objektif mengubah sinar sehingga ada perbedaan dalam fase antara sinar yang terdefraksi dengan sinar yang tidak mengalami defraksi. Jika sinar yang mengalami defraksi dan tidak terdefraksi bersama-sama lagi ada penurunan intensitas sinar, sebab adanya perbedaan fase. Semakin kecil objek yang sangat terang, defraksi lebih besar dan objek akan terlihat lebih gelap.

B.       Mikroskop Elektron

Mikroskop elektron adalah sebuah mikroskop yang mampu melakukan pembesaran objek sampai 2 juta kali, yang menggunakan elektro statik dan elektro magnetik untuk mengontrol pencahayaan dan tampilan gambar serta memiliki kemampuan pembesaran objek serta resolusi yang jauh lebih bagus daripada mikroskop cahaya. Mikroskop elektron ini menggunakan jauh lebih banyak energi dan radiasi elektromagnetik yang lebih pendek dibandingkan mikroskop cahaya. Mikroskop elektron digunakan untuk melihat secara rinci struktur mikroba. Lensa magnetik digunakan oleh elektron yang langsung berlawanan dengan objek dan memfokuskan elektron yang langsung berlawanan dengan objek yang dihasilkan pada layar atau papan fotografik. Sinar elektron mempunyai panjang gelombang yang lebih pendek dari sinar yang terlihat atau radiasi sinar ultraviolet. Secara teoritis batas pemisah untuk mikroskop elektron kira-kira 100 kali lebih kecil daripada batas pemisah untuk mikroskop cahaya sehingga mikroskop elektron dapat memberikan perbesaran yang jauh lebih besar daripada mikroskop cahaya dan memiliki daya pisah yang lebih besar. Spesimen pada mikroskop elektron harus disiapkan sebagai suatu lapisan kering yang teramat tipis dan dimasukkan antara kondensor magnetik dan obyektif magnetik (sistem optik kaca tidak digunakan pada mikroskop  elektron). Bayangan yang diperbesar akan tampak pada layar flouresen atau terekam pada film fotografik oleh kamera yang terpasang pada instrumen tersebut.

Terdapat dua jenis mikroskop elektron yaitu TEM (Transmission Electron Microscope) dan SEM (Scanning Electron Microscope).

·           TEM (Transmission Electron Microscope)

Seorang ilmuwan dari universitas Berlin yaitu Dr. Ernst ruska membangun mikroskop transmisi electron (TEM) yang pertama pada tahun 1931. Untuk hasil karyanya ini maka dunia ilmu pengetahuan menganugrahinya hadiah penghargaan nobel dalam fisika pada tahun 1986. Mikroskop transmisi electron (TEM) adalah sebuah mikroskop electron yang cara kerjanya mirip dengan cara kerja proyektor slide dimana electron ditembuskan ke dalam obyek pengamatan dan pengamat mengamati hasil tembusannya pada layar. TEM digunakan untuk mempelajari struktur subselular dan hubungan satu dengan yang lainnya. Dengan TEM, maka gambar yang dihasilkan akan memiliki tingkat resolusi yang jauh lebih tinggi daripada mikroskop cahaya,sehingga dapat melihat sesuatu yang memiliki ukuran 10.000 kali lebih kecil daripada ukuran objek terkecil yang bisa terlihat di mikroskop cahaya.

Kekurangan TEM adalah persiapan sampel untuk TEM umumnya memerlukan lebih banyak waktu dan pengalaman daripada kebanyakan teknik karakterisasi lainnya. Sebuah spesimen TEM tebalnya harus mendekati 1000Å .Selain itu memerlukan persiapan sampel yang lebih rumit untuk menghasilkan sebuah sampel yang cukup tipis, yang membuat analisis TEM  relatif memakan waktu dalam peletakan sampel yang kecil. Struktur sampel juga mungkin berubah selama proses persiapan. Bidang pandang relatif kecil, meningkatkan kemungkinan bahwa daerah dianalisis mungkin tidak menjadi ciri khas dari seluruh sampel serta ada potensi pula sampel rusak oleh berkas electron.

Agar pengamat dapat mengamati preparat dengan baik, diperlukan persiapan sediaan dengan tahap sebagai berikut :

1.        Melakukan fiksasi, yang bertujuan untuk mematikan sel tanpa mengubah struktur sel yang akan diamati. Fiksasi dapat dilakukan dengan menggunakan senyawa glutaraldehida atau osmium tetroksida.

2.        Pembuatan sayatan, yang bertujuan untuk memotong sayatan hingga setipis mungkin agar mudah diamati di bawah mikroskop. Preparat dilapisi dengan monomer resin melalui proses pemanasan, kemudian dilanjutkan dengan pemotongan menggunakan mikrotom. Umumnya mata pisau mikrotom terbuat dari berlian karena berlian tersusun dari atom karbon yang padat. Oleh karena itu, sayatan yang terbentuk lebih rapi. Sayatan yang telah terbentuk diletakkan di atas cincin berpetak untuk diamati.

3.        Pelapisan/pewarnaan, bertujuan untuk memperbesar kontras antara preparat yang akan diamati dengan lingkungan sekitarnya. Pelapisan/pewarnaan dapat menggunakan logam berat seperti uranium dan timbal.

SEM (Scanning Electron Microscope)

Tidak diketahui secara persis siapa sebenarnya penemu Scanning Electron Microscope ini. Publikasi pertama kali yang mendiskripsikan teori SEM dilakukan oleh fisikawan Jerman Dr. Max Knoll pada 1935, meskipun fisikawan jerman lainnya Dr. Manfren Von Ardenne mengklaim dirinya telah melakukan penelitian suatu fenomena yang kemudian disebut SEM hingga tahun 1937. Mungkin karena itu, tidak satupun dari keduanya mendapatkan hadiah nobel untuk penemuan itu. Pada tahun 1942 tiga orang ilmuan Amerika Dr. Valdimir Kosma Zworykin, Dr. James Hillier, dan Dr.Snijer,benar-benar membangun sebuah mikroskop electron metode pemindaian (SEM) dengan resolusi hingga 50 nm atau magnifikasi 8.000 kali. Sebagai perbandingan modern sekarang ini mempunyai resolusi hinggga 1 nm atau pembesaran 400.000 kali.  

Mikroskop electron cara ini memfokuskan sinar electron (electron bean) di permukaan obyek dan mengambil gambarnya dengan mendeteksi electron yang muncul dari permukaan obyek. Mikroskop pemindai electron (SEM) digunakan untuk study detil arsitektur permukaan sel (struktur jasad renik lainnya), dan obyek diamati secara tiga dimensi.

Cara terbentuknya gambar pada SEM berbeda dengan apa yang terjadi pada mikroskop optic dan TEM. Pada SEM, gambar dibuat berdasarkan deteksi electron baru (electron sekunder) atau electron pantul yang muncul dari permukaan sampel ketika permukaan sampel tersebut dipindai dengan  sinar electron.Elektron sekunder atau electron pantul yang terdeteksi selanjutnya diperkuat sinyalnya,kemudian besar amplitudonya ditampilkan dalam gradasi gelap terang pada layar monitor CRT (Cathode Ray Tube). Di layar CRT inilah gambar struktur objek yang sudah diperbesar bisa dilihat. Pada proses operasinya, SEM tidak memerlukan sampel yang di tipiskan,sehingga bisa digunakan untuk melihat objek dari sudut pandang tiga dimensi.

Perbedaan mendasar dari TEM dan SEM adalah pada cara bagaimana elektron yang ditembakkan oleh pistol elektron mengenai sampel. Pada TEM, sampel yang disiapkan sangat tipis sehingga elektron dapat menembusnya kemudian hasil dari tembusan elektron tersebut yang diolah menjadi gambar. Sedangkan pada SEM sampel tidak ditembus oleh elektron sehingga hanya pendaran hasil dari tumbukan elektron dengan sampel yang ditangkap oleh detektor dan diolah.

2.3     Metode Mikroskopik untuk Mikroskop Cahaya dan Mikroskop Elektron

Dalam pengamatan mikroorganisme dengan menggunakan mikroskop,baik itu dengan mikroskop cahaya maupun mikroskop electron menggunakan metode tertentu. Metode itu disebut dengan metode mikroskopik yang terdiri dari teknik mikroskop cahaya dan teknik mikroskop electron.

A.      Teknik Mikroskop Cahaya

o                   Teknik Preparat Basah dan Tetes Gantung

Mikroba hidup umumnya dapat dilihat melalui preparat basah dan preparat tetes gantung. Preparat basah dan tetes gantung memungkinkan pemeriksaan organisme  hidup yang tersuspensi dalam cairan untuk mengetahui motilitas atau proses–proses pengamatan dalam keadaan utuh. Preparat basah diperoleh dengan menaruh setetes cairan yang mengandung organisme pada kaca objek dan menutupnya dengan kaca yang sangat tipis yang dinamakan kaca tutup. Untuk mengurangi laju penguapan  dan meniadakan aliran udara, tetesan itu biasanya dilingkari dengan jeli petroleum atau bahan serupa sehingga antara kaca objek dengan kaca tutup terkatup rapat. Sedangkan untuk tetes gantung tersedia kaca objek dengan daerah cekung kedalam. Preparat basah dan tetes gantung terutama berguna untuk pengamatan aktivitas hidup seperti motilitas dan juga pengamatan morfologi mkroba yang dapat rusak karena perlakuaan dengan panas atau bahan kimia atau organisme itu sulit diwarnai.

o        Teknik Pewarnaan

Banyak senyawa organik berwarna (zat pewarna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis. Telah dikembangkan prosedur-prosedur pewarnaan untuk :

·           Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar

·           Mempermudah melihat ukuran dan bentuk mikroba.

·           Mengidentifikasi struktur luar dan dalam sel mikroba

·           Mengamati reaksi sel mikroba terhadap warna yang diberikan sehingga sifat-sifat  fisik dan kimia dapat diketahui.

Zat warna yang digunakan umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi bila mengenai bagian tubuh mikroba, karena zat warna tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif dan negative. Secara kimia zat warna digolongkan dalam:

ü  Zat warna basa yang bermuatan positif dan mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Misalnya metilen biru dan safranin.

ü  Zat warna asam yang bermuatan negatif dan mempunyai sifat mewarnai latar belakang sel. Misalnya Na-eosinat, eosin, fuksin, dan fuksin asam.

ü  Zat warna indiferen misalnya sudan III, dimetil-amid-azo-benzol.

Untuk mengamati mikroba dengan jelas dan mempelajari anatominya, digunakan bermacam-macam teknik pewarnaan antara lain:

Ø  Pewarnaan sederhana

Adalah pewarnaan tunggal dengan satu zat warna basa yang memberikan kontras yang baik antara spesimen dan latar belakangnya. Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis atau olesan yang sudah difiksasi. Lapisan tadi digenangi dengan larutan pewarna selama jangka waktu tertentu, kemudian larutan itu dicuci dengan air dan kaca objeknya dikeringkan dengan kertas pengisap. Biasanya sel terwarnai secara merata, tetapi pada beberapa organisme bilamana satu warna itu biru metilen, beberapa granula di dalam sel tampak terwarnai lebih gelap dibandingkan dengan bagian sel lainnya.

Ø  Pewarnaan Diferensial

Adalah pewarnaan spesimen dengan dua atau lebih zat warna basa untuk membedakan struktur selular. Contohnya pewarnaan gram, acidfast atau tahan asam dan giemsa. Pewarnaan gram adalah salah satu teknk pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri. Dalam proses ini olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan seperti ungu kristal, larutan yodium, alkohol dan safranin.

Ø  Pewarnaan Fluoresens

Adalah pewarnaan spesimen dengan warna yang berfluororesen (berpendar).

Ø  Pewarnaan Negatif

Adalah pewarnaan dengan zat warna asam sehingga spesimen dapat dibedakan dari latar belakananya. Contohnya pada pewarnaan kapsula. Pewarnaan negatif dan pewarnaan sederhana sering dikombinasikan untuk menambah kontras.

Langkah-langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang diwarnai untuk pemeriksaan mikroskopik:

§   Penempatan olesan atau lapisan tipis spesimen, pada kaca objek.

§   Fiksasi olesan itu pada kaca objek. Biasanya dengan pemanasan yang menyebabkan mikroorganisme itu melekat pada kaca objek.

§   Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial).

Faktor-faktor penentu keberhasilan dalam pewarnaan mikroba antara lain :

§   Fiksasi yang dilakukan sebelum zat warna digunakan bertujuan :

-          Melekatkan sel pada gelas objek.

-          Membunuh mikroba karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai daripada sel dalam keadaan hidup.

-          Mencegah terjadinya otolisis sel (pecahnya sel karena ensim yang ada di dalamnya).

-          Merubah daya ikat zat warna.

Fiksasi dapat dilakukan secara fisik dengan pemanasan atau pengeringan secara dingin sedangkan secara kimia dengan penambahan sabun, formalin, fenol, bouin.

§   Peluntur warna

Untuk menghilangkan warna sel yang telah diwarnai. Senyawa ini digunakan untuk menghasilkan keadaan yang kontras pada sel mikroba sehingga dengan jelas dapat diamati dengan mikroskop. Beberapa jenis peluntur warna antara lain:

-          Peluntur zat warna asam seperti HNO₃, HCl, H₂SO₄ dan campuran tersebut dengan alkohol.

-          Peluntur zat warna basa seperti KOH, NaOH, sabun dan garam-garam basa.

-          Peluntur zat warna lemah seperti alkohol, air, minyak cengkeh, asetat dan gliserin.

-          Garam dari logam berat seperti AgNO₃, CuSO₄

-          Garam dari logam ringan seperti Na₂SO₄, MgSO₄

§   Substrat

Berhubungan dengan kandungan utama sel terdiri dari karbohidrat, protein, lemak, dan asam nukleat

§        Intensifikasi perwarnaan

Pewarnaan mikroba dapat dipercepat dengan penambahan mordan, meningkatkan satu warna dan temperatur pewarnaan (60⁰ -70⁰ C)

§   Zat warna pembanding

Diberikan pada akhir pewarnaan denagn tujuan memberikan warna kontras pada sel mikroba yang diwarnai yang tidak menyerap warna pemula misal metilen biru, safranin.

B.       Teknik Mikroskop Elektron

Spesimen pada mikroskop elektron harus disiapkan sebagai suatu lapisan kering yang teramat tipis pada layar kecil dan dimasukkan ke dalam alat itu pada titik di  antara kondensor magnetik dan obyektif magnetik (sistem optik kaca tidak digunakan pada mikroskop elektron), sehingga spesimen untuk mikroskop elektron transimisi biasanya difiksasi dengan zat kimia seperti glutaraldehida untuk mencegah dekomposisi bila dikeringkan dan diiris. Sesudah spesimen difiksasi dengan glutaraldehida dan dehidrasi dengan aseton dan alkohol, dicetak dalam plastik untuk menjaga bentuk spesimen dan diiris tipis dengan ultramikrotom.

Banyak teknik yang telah dikembangkan untuk pemeriksaan mikroorganisme dengan mikroskop elektron. Adapun teknik-teknik yang dikembangkan dengan mikroskop elektron yaitu:

a.          Teknik bayangan logam (metal shadowing)

Teknik bayangan logam adalah teknik SEM yang digunakan untuk memberikan gambar tiga dimensi yang biasanya digunakan untuk mempelajari bentuk virus dan bakteri. Spesimen dilapisi dengan logam berat seperti emas atau palladium yang umumnya mengendap di sudut spesimen sehingga menciptakan bayangan spesimen.

b.                                                        Teknik pemecahan beku (freeze fracture)

Teknik pemecahan beku digunakan untuk mengamati struktur organela seluler dari membran yang biasanya digunakan untuk mengamati struktur kloroplas, mitokondria dan membran sitoplasma. Spesimen dibekukan dengan Freon 12 suatu refrigerator sampai -100⁰C kemudian diiris dalam vakum untuk memperoleh sayatan sel dan organelanya. Spesimen dilapisi dengan platinum dan karbon untuk memperoleh replika logam spesimennya. Hasil akhir menampakkan gambar yang tampak pada layar.

c.         Metode-metode pewarnaan baru

Metode-metode pewarnaan baru yaitu metode yang digunakan untuk mengiris sel-sel mikroba menjadi irisan tipis mikroskopis untuk pemeriksaan dan teknik radioaktif. Setelah spesimen yang diamati dengan mikroskop elektron tersebut telah diiris menjadi irisan tipis mikroskopis, kemudian irisan spesimen tersebut dijadikan preparat dengan melalui teknik-teknik pembuatan preparat yang digunakan pada mikroskop elektron. Teknik yang digunakan dalam pembuatan preparat ada berbagai macam tergantung pada spesimen dan penelitian yang dibutuhkan, antara lain:

·      Kriofiksasi yaitu suatu metode persiapan dengan menggunakan teknik pembekuan spesimen dengan cepat yang menggunakan nitrogen cair ataupun helium cair, dimana air yang ada akan membentuk kristal-kristal yang menyerupai kaca. Suatu bidang ilmu yang disebut mikroskopi cryo-elektron (cryo-electron microscopy) telah dikembangkan berdasarkan teknik ini.

·      Fiksasi yaitu suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik (seperti kenyataannya) dengan menggunakan glutaraldehid dan osmium tetroksida.

·      Dehidrasi yaitu suatu metode persiapan dengan cara menggantikan air dengan bahan pelarut organik seperti misalnya ethanol atau aseton.

·      Penanaman (Embedding) yaitu suatu metode persiapan dengan cara menginfiltrasi jaringan dengan resin seperti misalnya araldit atau epoksi untuk pemisahan bagian.

·      Pembelahan (Sectioning) yaitu suatu metode persiapan untuk mendapatkan potongan tipis dari spesimen sehingga menjadikannya semi transparan terhadap elektron. Pemotongan ini bisa dilakukan dengan ultramicrotome dengan menggunakan pisau berlian untuk menghasilkan potongan yang tipis sekali.

·      Pewarnaan (Staining) yaitu suatu metode persiapan dengan menggunakan metal berat seperti timah atau uranium untuk menguraikan elektron gambar sehingga menghasilkan kontras antara struktur yang berlainan di mana khususnya materi biological banyak yang warnanya nyaris transparan terhadap elektron (objek fase lemah).

·      Pembekuan fraktur (Freeze-fracture) yaitu suatu metode persiapan yang biasanya digunakan untuk menguji membran lipid. Jaringan atau sel segar didinginkan dengan cepat (cryofixed) kemudian dipatah-patahkan atau dengan menggunakan microtome sewaktu masih berada dalam keadaan suhu nitrogen (hingga mencapai -100⁰C).