Kultivasi Mikroba

2.1  Prinsip Nutrisi Mikroba

Berdasarkan cara-cara pengambilan nutrient maka mikroba dapat dibagi atas jasad osmotrof dan jasad fagotrof. Jasad osmotrof mengambil nutrien dalam bentuk larutan, misalnya bakteri dan fungi, sedangkan jasad fagotrof mengambil nutrien secara fagositosis lalu dicerna di dalam vakuola makanan, misalnya protozoa, jasad osmotrof mengeluarkan eksoenzim untuk memecah molekul besar misalnya protease untuk memecah protein menjadi asam amino, amilase untuk memecah pati menjadi gula, lipase memecah lemak menjadi asam lemak dan gliserol. Selanjutnya asam amino, gula, asam lemak, dan gliserol diserap ke dalam sel untuk digunakan.

·         Nutrisi yang dierlukan mikroba

Mikroba memerlukan nutrien sebagai sumber materi dan energy untuk menyusun komponen sel seerti genom, membrane plasma dan dinding sel. Bentuk nutrient yang diperlukan bermacam-macam, tergantung jenis mikrobanya, misalnya kebutuhan karbon untuk jasad fotoautotrof dalam bentuk CO₂, sedangkan bagi jasad kemoorganotrof dalam bentuk bahan organik. Dengan mengetahuia keperluan nutrien mikroba para ilmuwan dapat melakukan penelitian untuk menentukan peranan mikroba di alam dan kegunaannya dalam kehidupan manusia. Uraian berikut akan membahas mengenai tipe nutrisi yang dijumpai diantara mikroba.

1.         Kegiatan sel seperti biosintesis komponen sel, transport nutrient ke dalam sel dan motilitas memerlukan energy. Berdasarkan sumber energy, mikroba dibagi atas jasad fototrof yang menggunakan oksidasi senyawa kimia sebagai sumber energy. Dan jasad kemotrof yang menggunakan oksidasi senyawa kimia sebagai sumber energy. Terleas dari sumber energy yang digumakan, mikroba akan mengubah energy yang diperoleh menjadi senyawa pembawa energy yaitu ATP yang dapat dipakai untuk kegiatan sel. Ada 2 kelompok bakteri fototrof yaitu sianobakteri dan bakteri fotosintetik. Kedua kelompok ini mengubah energy cahaya menjadi ATP melalui proses fotosintesis. Mikroba khemotrof mengoksidasi senyawa kimia seperti glukosa atau ammonium, kemudian energy yang dilepaskan diubah menjadi ATP dalam proses fermentasi atau respirasi.

2.         Semua jasad hidup memerlukan karbon sebab unsurmkarbon terdapat dalam semua mikromolekul penyusun sel seperti rotein, karbohidrat, asam nukleat dan lipid. Berdasarkan sumber karbon, mikroba dapat digolongkan atas jasad heterotrof dan autotrof. Jasad autotrof  bila menggunakan karbondioksida sebagai sumber karbon, bila jasad tersebut memperoleh energinya dari cahaya disebut fotoautotrof, dan bila jasad tersebutmemperoleh energinya dengan cara mengoksidasi senyawa kimia maka disebut kemoautotrof. Jasad heterotrof menggunakan bahan organic sebagai sumber karbon.

3.    Semua jasad hidu memerlukan sulfur (blerang) dan fosfor. Sulfur dipergunakan untuk  membentuk asam amino metionin dan sistein serta koensim. Mikroba memperoleh sulfur dalam bentuk garam sulfat, H₂S, granula sulfur, thiosulfat atau dalam bentuk bahan organic (sistein dan metionin). Fosfor dipergunakan membentuk asam nukleat, fosfolipid dan koensim. Mikroba dapat mengambil fosfor dalam bentuk organic dan anorganik. Garam fosfat adalah yang paling sering digunakan sebagaisumber fosfat meskiun dapat pula memakai nukleotida.

4.    Semua jasad hidup memerlukan nitrogen sebab nitrogen dipergunakan untuk mensintesis asam amino, nukleotida dan vitamin. Keerluan akan nitrogen dapat dipenuhi dalam berbagai bentuk seperti protein atau polipeptida, garam nitrat atau amonium bahkan ada mikroba yang dapat mengambil dalam bentuk N₂ seperti Rhizobium dan Azotobacter.

5.    Semua jasad hidup memerlukan beberapa unsure logam, natrium, kalium, kalsium, magnesium, mangan, besi, seng, tembaga dan kobalt untuk pertumbuhannya yang normal. Mineral ini diperlukan untuk aktivitas enzim dan molekul yang lain misalnya Mg sebagai penyusun klorofil, Co untuk aktivitas enzim nitrogenase, dan Fe merupakan komponen sitokrom.

6.         Semua jasad hidup memerlukan vitamin (senyawa organik yang penting untuk pertumbuhan). Kebanyakan vitamin berfungsi membentuk substansi yang mengaktivasi enzim.meskipun semua bakteri membutuhkan vitamin di dalam proses metaboliknya yang normal, beberapa mampu mensintesis seluruh keperluan vitaminnya dari senyawa-senyawa lain di dalam medium. Yang lain tidak akan tumbuh kecuali bila ditambahkan satu atau lebih vitamin ke dalam mediumnya, seperti Leuconostoc mesentroides tidak mampu mensintesis beberapa asam amino dan vitamin sehingga harus ditambahkan dalam keadaan jadi ke dalam mediumnya.

7.         Oksigen merupakan unsure yang terdaat dalam molekul hayati seperti asam amino, nukleotida, gliserida dan molekul lain. Keperluan akan oksigen dipenuhi bersamaan dangan masuknya nutrient lain sepertirotein dan lipid. Disamping itu, oksigen dalam bentuk O₂ juga diperlukan untuk menjalankan respirasi aerobic.

8.         Semua jasad hidu memerlukan air bagi kehiduan karena semua aktivitas metabolism terjadi dalam lingkungan air. Ketersediaan air yang dapat digunakan dalam mikroba sering dinyatakan dengan aktivitas aair (Aw). Aktivitas air suatu bahan dapat dihitung dengan menentukan kelembaban relatifnya (RH). Untuk bakteri, semua nutrient harus ada dalam bentuk larutan sebelum dapat memasuki bakteri tersebut.

·         Kondisi fisik yang dierlukan untuk pertumbuhan

Selain menyediakan nutrisi yang sesuai untuk kultivasi bakteri, juga perlu disediakan kondisi fisik yang memungkinkan pertumbuhan optimum. Mikroba tidak hanya bervariasi dalam persyaratan nutrisinya, tetapi menunjukan respon yang berbeda terhadap kondisi fisik di lingkungannya. Untuk berhasilnya kultivasi mikroba diperlukan suatu kombinasi nutrisi serta lingkungan fisik yang sesuai. Ada 5 arameter lingkungan yang utama yang perlu diperhatikan dalam menumbuhkan mikroba yaitu temperature, kelembaban (RH), kadar oksigen, pH dan osmosis.

·         Temperatur

Karena semua proses pertumbuhan bergantung pada reaksi kimiawi dank arena laju reaksi-reaksi ini dipengaruhi oleh temperature, maka pola pertumbuhan mikroba sangat dipengaruhi oleh temperature. Temperature juga mem pengaruhi laju pertumbuhan dan penambahan jumlah sel. Keragaman suhu dapat juga mengubah proses-proses metabolic serta morfologi sel. Setiap mikroba tumbuh pada suatu kisaran suhu tertentu. Atas dasar ini maka mikroba ada yang bersifat psikrofilik yang tumbuh pada 0⁰ dampai 20⁰ C, mesofilik yang tumbuh pada 20⁰  sampai 45⁰ C dan termofilik yang tumbuh pada temperature 45⁰ sampai 80⁰ C. Temperature inkubasi yang memungkinkan pertumbuhan tercepat selama periode waktu yang singkat (12 sampai 24 jam) dikenal sebagai temperature pertumbuhan optimum.

·         Kondisi atmosfer seperti kadar oksigen, RH dan tekanan udara

Mikroba memperlihatkan keragaman yang luas dalam hal respons terhadap oksigen bebas dan atas dasar ini maka mikroba dibagi menjadi empat yaitu aerobik (memerlukan oksigen), anaerobik (tumbuh tanpa oksigen molekuler), anaerobic fakultatif (tumbuh pada keadaan aerobic dan anaerobik), dan mikroaerofilik (tumbuh bila ada sedikit oksigen atmosferik). Beberapa mikroba bersifat anaerobik obligat, bila terkena oksigen akan terbunuh, oleh karena itu untuk menumbuhkan mikroba anaerobic diperlukan teknik khusus agar tercapai keadaan anaerob. Keperluan penumbuhan jasad anaerob obligat dapat dipenuhi dengan menggunakan alat yang disebut anaerobic jar.

·         Konsentrasi ion hydrogen (pH)

pH optimum bagi kebanyakan mikroba terletak antara 6.5 sampai 7,5. Bagi kebanyakan mikroba pH minimum dan maksimum antara 4 sampai 9. Pertumbuhan mikroba sangat dipengaruhi oleh pH karena nilai pH sangat menentukan aktivitas enzim. Bila mikoba di kultivasi di dalam suatu medium yang mula-mula pH-nya 7 maka kemungkinan pH ini akan berubah. Pergeseran pH ini dapat sedemikian besar sehingga menghambat pertumbuhan. Pergeseran pH dapat dicegah dengan menggunakan larutan penyangga atau bufer dalam medium. Bufer merupakan senyawa yang dapat menahan perubahan pH misalnya KH2PO4 dan K2HPO4. Beberapa bahan nutrisi medium seperti pepton mempunyai kapasitas bufer. Perlu atau tidaknya suatu medium diberi bufer tergantung kepada maksud penggunaannya dan dibatasi oleh kapasitas bufer yang dimiliki senyawa-senyawa yang digunakan.

·         Tekanan osmosis

Tekanan osmosis adalah besarnya tekanan minimum yang dierlukan untuk mencegah aliran air yang menyebrangi membrane di dalam larutan. Contohnya : jika larutan 10 % sukrosa di dalam kantong membrane dialysis diletakkan dalam air dalam gelas maka molekul air yang ada dalam gelas akan mengalir ke dalam kantong analisis. Besarnya tekanan yang diperlukan untuk mencegah aliran molekul air dalam gelas ke dalam kantong dialisis merupakan nilai tekanan osmosis larutan sukrosa tersebut. Berdasarkan tekanan osmosanya maka larutan tempat pertumbuhan mikroba dapat digolongkan atas larutan hipotonis, isotonis dan larutan hipertonois. Mikroba biasanya hidup di lingkungan yang bersifat agak hipotonis sehingga air akan mengalir dari lingkungannya ke dalam sel sehingga sel menjadi mengembang kaku. Adanya dinding sel dapat mencegah pecahnya sel mikroba.

2.2       Media pertumbuhan dan penggunaannya di  laboratorium

Untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroba, diperlukan suatu substrat yang disebut media. Keragaman  yang luas dalam hal tipe nutrisi di antara mikroba diimbangi oleh tersedianya berbagai  media yang banyak macamnya untuk kultivasi. Agar mikroba dapat tumbuh dan berkembang dengan baik di dalam media, diperlukan persyaratan tertentu,yaitu:

a.       Media mengandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakkan  mikroba.

b.      Media mempunyai tekanan osmosa , dan  PH yang sesuai untuk mikroba.

c.       Media harus dalam keadaan steril.

Bentuk, susunan, dan sifat media

Bentuk media

            Bentuk media ditentukan oleh ada tidaknya penambahan zat pemadat seperti agar, gelatin. Berdasarkan bentuk dikenal tiga jenis media :

1.      Media Padat

            Yaitu media berbentuk padat yang mengandung agar 1-1.5%, misalnya nutrien agar. Kalau ke dalam media ditambahkan agar.  Jumlah agar  yang ditambahkan tergantung kepada jenis atau kelompok mikroba yang ditumbuhkan. Ada yang memerlukan kadar air tinggi sehingga penambahan agar harus sedikit tetapi ada pula yang memerlukan kandungan air rendah sehingga penambahan agar harus lebih banyak. Media padat umumnya dipergunakan untuk menumbuhkan bakteri, jamur, dan kadang-kadang mikroalga terutama dalam peremajaan dan pemeliharaan kultur murni dalam bentuk agar miring.

2.      Media Cair

            Yaitu media berbentuk cair yang tidak mengandung agar, misalnya nutrien broth. Umumnya media cair digunakan untuk menambah biomassa sel . Kalau ke dalam media tidak ditambahkan zat pemadat. Media cair dipergunakan untuk penumbuhan bakteri, ragi dan mikroalga.

3.      Media Semi Padat

            Yaitu media yang berbentuk padat pada suhu dingin, dan berbentuk cir bila suhu panas, misalnya media SIM (media yang digunakan untuk uji produksi sulfur, indol, motilitas)

            Kalau penambahan zat pemadat hanya setengah atau kurang dari seharusnya. Ini umumnya diperlukan untuk pertumbuhan mikroba yang banyak memerlukan kandungan air dan hidup anaerobic atau fakultatif untuk menambah biomassa sel.

Susunan media

Media dapat berbentuk :

1.    Media alami yaitu media yang disusun oleh bahan-bahan alami seperti kentang, telur, daging. Pada saat ini media alami yang banyak digunakan adalah dalam bentuk kultur jaringan tanaman atau hewan. Contoh penggunaan media alami adalah telur yang digunakan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan virus.

2.    Media sintetik yaitu media yang disusun oleh senyawa kimia. Misalnya media untuk pertumbuhan dan perkembangbiakkan Clostridium.

3.    Media semi sintetis yaitu media yang tersusun oleh campuran bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintesis. Misalnya kaldu nutrisi, wortel agar.

Sifat media

            Penggunaan media bukan hanya untuk pertumbuhan dan perkembangbiakkan mikroba tetapi juga untuk tujuan isolasi, seleksi, evaluasi, dan diferensiasi. Sehingga tiap media mempunyai spesifikasi sesuai dengan maksudnya. Berdasarkan sifatnya, media  dibedakan menjadi :

1.    Media umum : media yang dipergunakan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakkan satu atau lebih kelompok mikroba secara umum misalnya : agar kaldu nutrisi untuk bakteri, agar kentang dekstrosa untuk jamur.

2.    Media pengaya : media dimana suatu jenis mikroba diberi kesempatan untuk tumbuh dan berkembang lebih cepat dari jenis lainnya yang sama-sama berada di dalam satu media. Misalnya : kaldu selenit atau kaldu tetrationat untuk memisahkan Salmonella typhi dari mikroba lain yang ada dalam feses.

3.    Media selektif : media yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu atau lebih jenis mikroba tertentu tetapi akan menghambat atau mematikan jenis-jenis lainnya. Misalnya : media SS ( Salmonella-Shigella ) agar untuk menumbuhkan Salmonella dan Shigella.

4.    Media diferensial : media yang dipergunakan untuk penumbuhan mikroba tertentu serta penentuan sifat-sifatnya seperti media agar darah untuk penumbuhan bakteri hemolitik.

5.    Media Penguji : media yang dipergunakan untuk pengujian senyawa tertentu dengan bantuan mikroba. Misalnya media penguji vitamin, antibiotika, residu pestisida.

2.3       Sterilisasi

            Bahan atau peralatan yang dipergunakan dibidang mikrobiologi harus dalam keadaan steril artinya bahan atau peralatan tersebut bebas dari mikroba baik yang akan mengganggu media atau menganggu kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan.

Sterilisasi yang umum dilakukan adalah :

            Sterilisasi secara fisik :  dengan menggunakan udara panas atau uap air panas dengan tekanan tinggi. Misalnya dengan penggunaan autoklap dengan temperatur 121˚C dengan tekanan 15 lbs. Waktu yang diperlukan tergantung banyak sedikitnya bahan atau medium yang disterilkan, umumnya berkisar antara 15 sampai 20 menit.

            Sterilisasi secara kimia : senyawa kimia yang banyak digunakan adalah larutan CuSO4, AgNO3, HgCI2, dan ZnO serta alkohol dengan kadar antara 50 – 75% karena cepat menyebabkan koagulasi protein mikroba. Larutan garam seperti NaCI (9%), KCI (11%) dan KNO3 (10%) dapat digunakan karena tekanan osmotiknya yaitu dehidrasi protein pada substrat. Sedang asam kuat dan basa kuat dapat digunakan karena dapat menghidrolisis isi sel mikroba. Larutan KmnO4 (10%) dan HCI (1,1%) dapat mengoksidasi substrat. Sedang larutan CuSO4 digunakan untuk algisida. Khlor dan senyawa khlor digunakan sebagai desinfektan terutama pada tempat penyimpanan air. Juga larutan formalin atau formaldehida dengan kadar antara 4 -20%.

Sterilisasi secara mekanik.

            Untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi ataupun tekanan tinggi mengalami perubahan atau penguraian, sterilisasi dilakukan secara mekanik yaitu dengan saringan. Penyaringan yang digunakan dengan penggunaan filter seperti filter Berkefeld, Chamberland dan Seitz juga filter glukosa, gelas atau porselen. Jenis filter mana yang akan digunakan tergantung kepada tujuan penyaringan dan bahan yang akan disaring.

2. 4  Metode Kultivasi Mikroba

            Di habitat alaminya, mikroorganisme biasanya tumbuh dalam populasi yang kompleks dan terdiri dari beberapa spesies. Hal ini menyebabkan penelitian mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat menjadi sulit untuk dilakukan. Oleh karena itu, diperlukan suatu teknik untuk memisahkan populasi yang kompleks ini menjadi spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni adalah suatu populasi sel yang ditumbuhkan dari satu sel induk.

            Proses isolasi dan upaya mempertahankan keadaan murni memerlukan teknik aseptik . Oleh karena itu, sebelum mengkultur suatu mikroba harus dilakukan suatu proses sterilisasi.

2.4       Teknik Kultivasi Mikroba

            Setelah semua bahan dan alat yang akan digunakan dalam proses kultivasi disterilkan, maka dimulailah proses isolasi untuk mendapatkan biakan murni.Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum. Di bawah ini ada beberapa teknik inokulasi yang umum dilakukan di laboratorium mikrobiologi.

a. Teknik Penyebaran (The Spread-Plate Technique)

            Teknik penyebaran yang lebih sering disebut dengan Spread-Plate adalah teknik langsung dan mudah untuk mendapatkan suatu biakan murni. Di bawah ini adalah gambar saat menginokulasi mikroba dengan menggunakan teknik Spread-Plate.

            Campuran dari beberapa spesies bakteri disebarkan di permukaan medium agar, sehingga setiap sel akan tumbuh menjadi koloni yang terpisah sempurna dan dapat dilihat secara makroskopis berupa kumpulan mikroba di atas medium padat. Setiap koloni yang terbentuk merupakan biakan murni. Di bawah ini adalah gambar dari biakan murni yang diperoleh dengan menggunakan teknik Spread-Plate.

  b. Teknik Goresan (The Streak-Plate Technique)

            Biakan murni juga dapat diperoleh dengan teknik goresan ( Streak-Plate Technique ). Inokulum digoreskan di atas medium dengan memakai ose menurut pola tertentu, yaitu:

      Goresan T

            Untuk membuat biakan murni dangan teknik goresan T, ada beberapa langkah yang harus diikuti, yaitu :

·         Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan hutuf T pada bagian luar dasar cawan petri.

·         Inokulasi daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung.

·         Panaskan ose dan biarkan dingin kembali.

·         Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan di daerah II.

·         Pijarkan kembali ose dan biarkan dingin kembali.

·         Prosedur diatas diulang untuk daerah III

- Goresan Kuadran

            Teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi empat.

- Goresan Radian

·         Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan.

·         Pijarkan ose dan dinginkan kembali.

·         Putar lempengan agar 90o dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir lempengan.

·         Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus di atas goresan sebelumnya.

·         Pijarkan ose.

- Goresan Sinambung

·         Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan lempengan agar.

·         Jangan pijarkan ose, putar lempengan 1800, gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar. Pola goresan sinambung dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

            Setelah inkubasi, sel-sel mikroba memperbanyak diri dan dalam waktu 18-24 jam akan terbentuk suatu massa sel yang disebut koloni. Koloni yang terbentuk ini adalah biakan murni. Di bawah ini adalah hasil kultivasi berupa biakan murni yang diperoleh dengan teknik goresan.

c. Teknik lempeng tuang (Pour Plate Technique )

Teknik pour-plate (lempeng tuang) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stok kultur bakteri. Teknik ini biasa digunakan pada uji TPC (Total Plate Count). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar. Kultivasi mikroba dengan teknik ini dimulai dengan mengencerkan kultur bakteri yang telah ada dengan aquades. Selanjutnya, diaduk hingga rata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali. Larutan dilusi tadi sebanyak + 1 ml dituang ke dalam cawan petri. Cawan petri diputar secara perlahan-lahan di atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur mikroba. Terakhir, inkubasi kultur ini pada kondisi yang sesuai. Tahapan di atas diilustrasikan pada gambar 5 di bawah ini.

Biakan murni yang dihasilkan, jika disimpan dalam jangka waktu yang lama akan mudah sekali mengalami mutasi. Ini berarti, biakan murni yang disimpan terlalu lama bukan lagi biakan murni yang semula. Oleh karena itu, ada beberapa hal yang harus dilakukan untuk mencegah atau setidaknya mengurangi kemungkinan terjadinya mutasi, yaitu :

-          Secara periodik, biakan harus dipindahkan ke medium baru, sebaiknya pemindahan dilakukan pada fase log.

-          Biakan harus disimpan pada suhu rendah dan terhindar dari radiasi.

Mikroba diliofilisasikan, yaitu dimasukkan dalam ampul berisis susu kering bercampur CO₂ kemudian disimpan pada tempat bersuhu rendah.

Karakteristik Biakan Mikroba

            Karakteristik pertumbuhan mikroba dalam medium pertumbuhan menunjukkan morfologi, mekanisme pembelahan, dan aktivitas metabolismenya. Pertumbuhan antara medium cair dan medium padat memberikan bentuk dan karakteristik yang berbeda.

            Pada biakan di medium cair, karakteristik yang ditimbulkan oleh pertumbuhan mikroba, yaitu :

a.         Terbentuk endapan

Terbentuknya endapan menunjukkan sel mikroba membentuk agregat sehingga berat dan mengendap, misalnya Staphylococcus aureus.

b.        Terbentuk pelikel

Terbentuknya pelikel disebabkan karena mikroba memiliki pili atau glikokaliks yang menyebabkan sel yang satu melekat dengan yang  lain, misalnya Mycobacterium phlei

c.         Terlihat keruh

Terlihatnya kekeruhan menunjukkan bahwa mikroba yang tumbuh tersebar merata dan biasanya mikrobanya bersifat motil.

            Pada biakan di medium padat, karakteristik yang ditimbulkan oleh pertumbuhan mikroba adalah dengan terbentuknya suatu kelompok yang dinamakan koloni. Bentuk koloni berbeda-beda untuk setiap spesies, dan bentuk itu merupakan ciri khas bagi suatu spesies tertentu. Pengamatan mikroba dapat dilakukan secara individual, satu persatu, maupun secara kelompok dalam bentuk koloni, dan sifat-sifatnya dapat diketahui melalui koloni yang tumbuh di medium permukaannya. Satu koloni bakteri yang terpisah dengan koloni lainnya dapat diamati tipe pertumbuhan pada masing-masing media, diantaranya dilakukan terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni dan permukaan koloni.

Koloni yang tumbuh terpisah ditumbuhkan kembali untuk mendapatkan isolat murni. Isolasi murni dilakukan dengan mengoleskan ose steril pada koloni dalam kultur campuran yang benar-benar terpisah satu sama lain. Olesan tersebut digores pada media padat agar miring dalam tabung reaksi.

Koloni yang tumbuh dalam media ini merupakan isolat murni, yang hanya berasal dari satu jenis bakteri saja. Koloni yang tumbuh dapat dikarakerisasi berdasarkan tipe pertumbuhannya pada media agar miring.